在实验室展示生命从化学前体中出现，即从合理原始汤与能源无辅助涌现自我复制的RNA和蛋白质细胞。细胞可为有边界隔室。须满足：涌现细胞在充足原始汤与能源下数量增至少10⁶倍（约20代）；分裂可无限持续；细胞有明确编码可遗传信息方式，分子组成部分由细胞内信息决定，优先核酸或多肽存储。
正文
在实验室展示从化学前体自发产生生命。具体：展示在无辅助情况下，从合理的原始汤和能源中自发产生基于RNA和蛋白质的自复制细胞。细胞指有任何明确边界的隔室。成功需满足：第一，证明在充足原始汤和能源下，新兴细胞数量至少增加10⁶倍（约20代）；第二，分裂能无限持续（如逐代单调缩小体积的方案不被接受）；第三，细胞有明确遗传信息编码方式，即细胞分子组成至少部分由内部信息因果决定。优先核酸或多肽等聚合物存储信息，遗传信息模糊或有争议的方案默认拒绝。
展示对活体野生型小鼠进行低温保存并高存活率恢复的能力。具体：展示活体完整野生型成年小鼠全身冷冻或玻璃化后的可逆保存。小鼠须冷冻至少24小时，恢复存活率>99%，且无永久器官损伤或身体伤害。允许体细胞基因工程但不鼓励。实验须伦理批准。
创造能“反向翻译”任意肽序列为RNA或DNA的酶。具体：创造纯化的蛋白质催化剂或固定蛋白复合物，能在无核酸模板、预附序列条码、残基特异性操作循环或数据库查询下，过程性地读取未标记多肽，并按预注册密码子约定合成编码其残基序列的共价核酸链。所得核酸须兼容普通聚合酶、连接酶等（若用非RNA/DNA核酸，须兼容下游扩增或测序）。完成挑战须预注册、合成并混合至少100条各至少50氨基酸的随机肽序列，并证明通过这些肽反向翻译和测序（不查字典）能以至少90%序列准确率推断肽序列，平均读长至少25残基，平均读质分至少Q10。
制造特异性和酶周转超越自然帕累托前沿的Rubisco酶。具体：制造催化核酮糖-1,5-二磷酸羧化的酶，其对二氧化碳相对于氧的特异性（S c/o）至少高于或等于 Galdieria Partita Rubisco，且酶周转（k cat）至少高于或等于玉米Rubisco。成功须用配对酶测定以 G. Partita 和玉米 Rubisco 分别为对照测量。酶可全新设计、自然发现或工程改造。
制造使用四碱基密码子的活细胞。具体：制造所有蛋白质编码序列（包括翻译机制本身）都以不间断非重叠四联体密码子编码、且无任何可检测的三联体解码的活复制细胞。编码方案须真实四联体，即密码子内突变非同义概率与突变位置无关（如前三位置总足以定氨基酸的方案不接受）。
展示成年野生型小鼠肢体再生能力。具体：在成年野生型小鼠截肢后，可重复再生肢体。再生后小鼠在标准运动功能测试中表现与对照无区别，再生肢体感觉知觉无区别，盲法观察者无法基于非侵入观测分辨哪肢再生。实验须伦理批准。
展示在细菌宿主中生产基因治疗载体的能力。具体：在细菌中生产感染性复制缺陷型 AAV 和慢病毒。颗粒须含预设病毒基因组；物理衣壳与病毒基因组比、感染单位与病毒基因组比须类似哺乳动物细胞培养纯化病毒；病毒基因组须核酸酶抗性强。预计细菌产慢病毒比AAV难，故单独展示AAV生产算部分成功。
展示按需生产特异性高效切割特定蛋白序列的酶的能力。具体：给定内源折叠蛋白中盲选的可接近位点，证明能前瞻性设计在活细胞中高效切割该位点的蛋白酶。该酶催化效率和全程脱靶切割须类似或优于常用位点特异性蛋白酶。当对20个预注册位点以>80%成功率证明后挑战完成。预注册后24小时内须给出蛋白设计，评估前不得进行湿实验（除生产设计蛋白用于检测），故注册后不允许筛选和靶点特异性进化。 注：较弱形式是展示对溶液中特定预注册肽序列（连同脱靶序列）特异高效切割的酶，此算部分成功。
展示生产针对胞内靶标的蛋白结合剂的能力。具体：证明能零样本设计蛋白结合剂，无需进一步进化优化，在药理浓度下从胞外给药即可在活细胞中可靠结合预注册胞内蛋白靶标。入胞机制须治疗背景合理，即转染、胞内抗体表达、电穿孔、膜破坏等不允许。对20个预注册靶标以80%成功率证明后完成。靶标预注册后24小时内出蛋白设计，评估前除生产蛋白外不得湿实验（不允许筛选和靶点特异性进化）。
展示任意肽底物的指数扩增。具体：在单锅反应中，从无核酸模板或预成型支架，以氨基酸单体为原料，展示输入蛋白依赖性地合成新的、全长度、序列保真共价多肽拷贝。完成须预注册、合成并混合至少100条各至少50氨基酸随机肽，并证明溶液中这些肽丰度扩增至少1000倍且每残基序列准确率≥90%。必要时可加不影响扩增的修饰便于分析。不允许依赖显式测序肽的方法，也不允许依赖反向翻译生成核酸中间体的方法（因与另一千年问题重复）。
生产全套向5′方向作用的聚合酶。具体：生产全套3′>5′聚合酶，媲美常用5′>3′聚合酶，包括3′>5′ DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和RDRP。蛋白持续合成能力和错误特征须类似或优于Taq、T7 RNA pol、M-MLV RT、Phi 6 RDRP。可全新设计、自然发现或工程改造。
创造与天然家族无序列或结构同源的新固氮酶。具体：该蛋白将N₂转氨速率至少接近天然蛋白数量级，且与所有已知固氮酶及类固氮酶蛋白序列和结构相似性远低于阈值。可全新设计、自然发现或工程改造。
评论
讨论整体偏向质疑：多数人认为这份「生物学千年难题」清单既没有交代发起者和验证机制，也配不上与数学千年大奖并列，更像是一份由外行或 AI 拼凑、以便商业化的工程任务书；少数人则认真指出清单漏掉的关键问题，并逐条挑出其中站不住的条目。分歧的主轴不是「这些问题重不重要」，而是「谁有资格以这种方式定义生物学问题、又凭什么用悬赏来驱动研究」。
质疑这份清单凭什么与数学千年难题并列
- 发起者是谁、结果由谁验证、有没有奖金，一概没交代，却直接搬用「千年难题」的名号（较多人）
- 既然标准如此随意，那任何人都能列一份问题清单再自己命名（较多人）
- 生物学的基础理解远不及数学成熟，未知的未知太多；清单又把自己限定在实验室可验证的范围内，等于剔除了生物体本身和细胞间互作这些真正困难的部分（较多人）
- 更合适的类比是：生物学早就有公认的硬问题，只是不需要靠网站来宣布
所以任何人都能列一份问题清单，然后给它贴上千年难题的名字？（@alabhyajindal）
认为清单是外行拼凑，而且几乎全是工程题
- 所有条目都是工程目标，而非对生命机制的理解，这一点本身就说明作者的问题意识（较多人）
- 大量条目形如「设计一个蛋白……」，其中反向翻译酶和蛋白扩增被点名批评：无法对蛋白做选择性指数扩增，真要做也该走质谱蛋白质组学、合成 DNA 再表达的路子（较多人）
- 氮化酶条目的表述也被指草率——要求新蛋白速率与天然酶同量级，同时与所有已知固氮酶的序列和结构相似度都远低于阈值，专家不会这样定义问题（少数人）
- 清单里几乎没有小分子或生物催化，网站本身也被怀疑是 AI 速成产物（较多人）
只要懂一点蛋白质化学就知道，这事得不偿失。（@dnautics）
清单遗漏了更该上榜的问题
- 用细菌生产燃料、降解塑料这类合成生物学目标（少数人）
- 形态发生（少数人）
- 蛋白折叠远未被 AlphaFold 真正解决，很多相关问题都够格入选（较多人）
- 逆转阿尔茨海默病，或先做出高保真的人类疾病体外与动物模型——这类问题的回报远超一百万美元（少数人）
- 延缓乃至逆转衰老（少数人）
你会以为延缓或逆转衰老会出现在清单上。（@Haunt1000）
对个别条目提出技术性反驳
- 整体冷冻并复苏活体小鼠在五十年代就用微波实现过，恢复率约七成且未见副作用；后来放弃不是因为做不到，而是解冻剂需求量随体积立方增长，到猫的尺寸就无法及时排出，能量会直接烧毁组织（较多人）
- Rubisco 不太可能再被优化：自然界有充分动机和数十亿年时间，速度与特异性只能二选一（少数人）
- 生命起源这一条：证明氨基酸、DNA 或 RNA 能自发形成，不等于说明生命如何起源，编码问题和系统组装问题至今无人解决（较多人）
- 九十年代的教科书曾把放电实验当作「生命起源已解决」，那个「因此」是谎言（较多人）
证明氨基酸、DNA 或 RNA 能够形成，并不等于证明了生命如何起源。（@shevy-java）
认为用悬赏清单驱动生物学是本末倒置
- 生物学已有自己的千年难题，回报远超一百万美元，比如逆转阿尔茨海默病（较多人）
- 真正该投入的是大量无法治疗的慢性病，而清单里的问题都不是通往那里的路径（较多人）
- 这些条目恰好都通向巨大的商业机会，很难不让生物学家怀疑其动机（少数人）
生物学早就有自己的千年难题，回报远超一百万美元，例如逆转阿尔茨海默病。（@pfisherman）
有价值的补充
- Michael Levin 在生物电方向的工作被认为已接近「体细胞肢体再生」这一条，但发帖人自认不是本行，请专家指正（@daoboy）
- 所谓「模型差距」不只存在于人和动物之间：同一药物、同一剂量，在不同基因型和肠道菌群的人身上反应也差异巨大（@hn3ufz62f7）
- 维基百科上早已有「未解决生物学问题列表」，这类清单并不新鲜（@unknown-unknown）
- 一条玩笑代表了社区情绪：有人建议给 AI 对齐也立一份千年难题，这样前沿实验室才会真去解决它——与其说是提议，不如说是对「靠悬赏清单驱动研究」的讽刺（@doctoboggan）